Oporność bakterii ESBL: wyzwania i metody diagnostyczne

Jakie wyzwania stawia oporność bakterii ESBL?

Infekcje wywoływane przez bakterie gram-ujemne produkujące enzymy ESBL (extended-spectrum β-lactamase) stanowią poważne globalne zagrożenie dla zdrowia publicznego. Najnowsze dane wskazują, że rocznie powodują one ponad 100 000 zgonów na całym świecie. Standardem leczenia tych zakażeń są karbapenemy, jednak narastająca oporność na tę grupę antybiotyków może w przyszłości ograniczyć ich zastosowanie. Z tego powodu trwają intensywne badania nad skutecznością leków alternatywnych wobec karbapenemów. Zakażenia dróg moczowych to istotne źródło bakteriemii wywołanych przez Enterobacterales. W tym kontekście aminoglikozydy, które osiągają wysokie stężenia w moczu, oraz fluorochinolony o wysokiej biodostępności stanowią ważne alternatywy dla karbapenemów.

W 2019 roku Clinical & Laboratory Standards Institute (CLSI) zrewidował punkty odcięcia dla fluorochinolonów w przypadku Enterobacterales. Zmiana ta została podyktowana dowodami sugerującymi, że poprzednie wartości były zbyt wysokie, by wykryć oporność na fluorochinolony o niskim poziomie. Ta niskostopniowa oporność uznawana jest za klinicznie istotną, ponieważ pacjenci z takimi drobnoustrojami i suboptymalnymi stężeniami leku są narażeni na potencjalne niepowodzenie terapii. Retrospektywne badanie oceniające kliniczny wpływ tych zmian sugerowało, że terapia lewofloksacyną przy wcześniej akceptowanych wyższych punktach odcięcia była związana z większą śmiertelnością. “Wyniki naszego badania jednoznacznie wskazują, że aktualizacja punktów odcięcia dla fluorochinolonów była konieczna dla zapewnienia bezpieczeństwa pacjentów” – podkreślają autorzy badania.

Podobnie w 2022 roku CLSI obniżył punkty odcięcia dla aminoglikozydów w przypadku Enterobacterales. Punkt odcięcia dla wrażliwości na gentamycynę i tobramycynę został obniżony z ≤ 4 do ≤ 2 mg/L, dla wyników pośrednich z 8 do 4 mg/L, a dla oporności z ≥ 16 do ≥ 8 mg/L. Zmiana ta głównie doprowadziła do dostosowania punktów odcięcia CLSI do tych stosowanych przez European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST) i uwzględniła dane dotyczące epidemiologicznych punktów odcięcia przedstawione w ramach programu SENTRY Antimicrobial Surveillance Program.

Jakie metody AST stosujemy?

Kluczowym krokiem w proponowaniu ciprofloksacyny i aminoglikozydów w leczeniu bakteriemii ESBL jest zapewnienie, że powszechnie stosowane metody oznaczania wrażliwości na antybiotyki adekwatnie mierzą wrażliwość na te leki. Dlatego też oceniono wydajność systemu VITEK 2 (bioMérieux, Francja) oraz metody dyfuzyjno-krążkowej w porównaniu ze złotym standardem, jakim jest metoda mikrorozcieńczeń w bulionie (BMD) w wykrywaniu wrażliwości na ciprofloksacynę i aminoglikozydy u niewrażliwych na ceftriakson szczepów Escherichia coli i Klebsiella pneumoniae – najczęściej spotykanych Enterobacterales opornych na cefalosporyny trzeciej generacji, przy zastosowaniu nowych punktów odcięcia CLSI.

W badaniu zidentyfikowano retrospektywnie niewrażliwe na ceftriakson szczepy E. coli i K. pneumoniae, definiowane jako MIC ≥ 2 µg/mL, z dodatnich posiewów krwi pobranych między styczniem 2021 a czerwcem 2023 od pacjentów hospitalizowanych w trzech szpitalach w Montrealu, w Quebecu. Były to unikalne próbki kliniczne, z nie więcej niż jedną próbką od każdego pacjenta. Wybrano izolaty z krwi, aby skupić się na patogenach związanych z zagrażającymi życiu infekcjami. Łącznie uwzględniono 94 izolaty bakteryjne: E. coli (76 izolatów) i K. pneumoniae (18 izolatów). Każdy izolat był namnażany w duplikacie z bulionu glicerolowego na agar z krwią i wysyłany do laboratorium referencyjnego Element/JMI Laboratories (Iowa, USA) w celu przeprowadzenia testów metodą mikrorozcieńczeń w bulionie (BMD) i testów dyfuzyjno-krążkowych.

Testy BMD przeprowadzono zgodnie z CLSI M07-Ed11 przy użyciu bulionu Mueller-Hinton z dodatkiem kationów. Wykonano testy wrażliwości na ciprofloksacynę (Sigma-Aldrich; 17,850), gentamycynę (USP; 1289003) i tobramycynę (Sigma-Aldrich; T4014). BMD stosowano jako standard referencyjny, z którym porównywano metodę dyfuzyjno-krążkową i system VITEK 2. Kontrolę jakości przeprowadzano przy użyciu szczepów E. coli ATCC 25922 i Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 każdego dnia testowania. Czy te rygorystyczne metody badawcze zapewniają wiarygodność uzyskanych wyników i mogą wpłynąć na zmianę praktyki klinicznej?

Testy dyfuzyjno-krążkowe przeprowadzono na agarze Muller-Hinton (Remel; R04052) z użyciem krążków zawierających 10 μg gentamycyny, 10 μg tobramycyny i 5 μg ciprofloksacyny. Inokulum przygotowano zawieszając kolonie z płytek agarowych z krwią inkubowanych przez noc w jałowym roztworze soli fizjologicznej do standardu 0,5 McFarlanda. Testy BMD i dyfuzyjno-krążkowe przeprowadzono przy użyciu tego samego inokulum. Krążki z ciprofloksacyną i aminoglikozydami umieszczono na powierzchniach zaszczepionych płytek agarowych i inkubowano w temperaturze 35°C przez 16 do 18 godzin. Testowanie i interpretację przeprowadzono zgodnie z CLSI M02-A12 i M100-ED34.

Automatyczne testy wrażliwości na antybiotyki przeprowadzono przy użyciu kart VITEK 2 AST-N391 (bioMérieux, Francja) zgodnie z instrukcjami producenta. Testowanie przeprowadzono w Laboratorium Mikrobiologii Klinicznej McGill University Health Centre (MUHC). Do interpretacji wyników dla ciprofloksacyny zastosowano punkty odcięcia z 2019 roku: MIC ≤ 0,25 μg/ml – wrażliwy; MIC > 0,25 i < 1 μg/ml - pośredni; MIC ≥ 1 μg/ml - oporny. Dla gentamycyny i tobramycyny zastosowano punkty interpretacyjne z 2022 roku: MIC ≤ 2 μg/ml - wrażliwy; MIC 4 μg/mL - pośredni; MIC ≥ 8 μg/ml - oporny. Interpretację MIC przeprowadzono przy użyciu punktów odcięcia ustanowionych w CLSI M100-Ed34.

Czy wyniki testów zmieniają podejście terapeutyczne?

Używając BMD jako standardu referencyjnego, porównano wydajność metody dyfuzyjno-krążkowej i systemu VITEK 2 w klasyfikowaniu izolatów jako wrażliwych i niewrażliwych. W przypadku systemu VITEK 2 użyto istniejących kart i zastosowano zaktualizowane punkty odcięcia do interpretacji wrażliwości na podstawie raportowanych wartości MIC. Zgłoszono proporcje prawidłowo zidentyfikowanych jako wrażliwe i niewrażliwe z 95% dokładnymi przedziałami ufności dwumianowymi. Błędy skategoryzowano jako mniejsze (miE) (pośredni raportowany jako wrażliwy lub oporny; wrażliwy lub oporny raportowany jako pośredni), poważne (ME) (błędna kategoryzacja prawdziwie wrażliwych izolatów jako opornych; fałszywie opornych) lub bardzo poważne (VME) (błędna kategoryzacja prawdziwie opornych izolatów jako wrażliwych; fałszywie wrażliwych). Wszystkie analizy przeprowadzono przy użyciu STATA wersja 17.

Wyniki badania ujawniły, że 21 z 94 (22,3%) izolatów zostało scharakteryzowanych przez BMD jako wrażliwe na ciprofloksacynę, a 73 (77,7%) jako niewrażliwe [składające się z 2 (2,1%) pośrednich i 71 (75,5%) opornych]. Metoda dyfuzyjno-krążkowa prawidłowo skategoryzowała 14/21 (66,6%; 95% CI 43,0-85,4%) wrażliwych zidentyfikowanych przez BMD (wszystkie 7 były miE) i 73/73 (100%; 95% CI 95,1-100%) niewrażliwych. W związku z tym ogólny wskaźnik miE wynosił 7,4% (95% CI 3,0-14,7%) bez ME lub VME (95% CI 0-3,8%). Zgodność kategoryczna metody dyfuzyjno-krążkowej wynosiła 92,6%.

W porównaniu, VITEK 2 prawidłowo skategoryzował tylko 6/21 (28,6%; 95% CI 11,3% do 52,2%) izolatów, które były wrażliwe według BMD (11 miE, 4 ME), jednocześnie prawidłowo kategoryzując 73/73 (100%; 95% CI 95,1-100%) tych niewrażliwych według BMD (2 miE). W związku z tym wskaźnik błędów mniejszych wynosił 13,8% (95% CI 7,6-22,5%), wskaźnik ME 19,0% (95% CI 7,7-40,0%), a wskaźnik VME 0% (97,5% CI 0-3,8%). Zgodność kategoryczna VITEK 2 wynosiła 81,9%. “Nasze wyniki jednoznacznie wskazują, że system VITEK 2 wykazuje tendencję do nadmiernego klasyfikowania oporności na ciprofloksacynę w przypadku bakterii ESBL-dodatnich, co może prowadzić do niepotrzebnego ograniczenia opcji terapeutycznych” – podkreślają badacze.

W przypadku aminoglikozydów, 65 z 94 (69,1%) izolatów było wrażliwych na gentamycynę według BMD, a 53 z 94 (56,4%) było wrażliwych na tobramycynę. Metoda dyfuzyjno-krążkowa i VITEK 2 prawidłowo skategoryzowały 65/65 (100%; 95% CI 94,5-100%) sklasyfikowanych przez BMD jako wrażliwe na gentamycynę i 29/29 (100%; 95% CI 88,1-100%) niewrażliwych izolatów bez żadnych błędów. Dla tobramycyny, metoda dyfuzyjno-krążkowa prawidłowo skategoryzowała 52/53 (98,1%; 95% CI 90,0-100%) izolatów wrażliwych według BMD (1 miE) i 39/41 (95,1%; 95% CI 83,5-99,4%) izolatów niewrażliwych (2 miE). W strefie pośredniej metody dyfuzyjno-krążkowej wystąpiło dodatkowo 9 błędów mniejszych z organizmami testującymi opornymi według BMD.

VITEK 2 prawidłowo skategoryzował 52/53 (98,1%; 95% CI 90,0-100%) izolatów wrażliwych według BMD (1 miE) i 40/41 (97,6%; 95% CI 87,1-99,9%) izolatów niewrażliwych (1 miE). Zaobserwowano dwa dodatkowe błędy mniejsze dla MIC w zakresie pośrednim z organizmami testującymi opornymi według BMD; dodatkowe 2 błędy mniejsze z organizmami sklasyfikowanymi jako “oporne” przez VITEK 2 testującymi pośrednio według BMD.

Jak wyniki badań przekładają się na praktykę kliniczną?

Badacze donoszą, że w porównaniu z BMD, metoda dyfuzyjno-krążkowa dla ciprofloksacyny nie daje ME ani VME, podczas gdy w przypadku VITEK 2 stwierdzono wskaźnik ME wynoszący 19,0% i wskaźnik VME 0%. Dla aminoglikozydów, testowanie metodą dyfuzyjno-krążkową lub VITEK 2 nie prowadziło do żadnych ME ani VME. Dlatego wykazano, że w przypadku wysokiego prawdopodobieństwa oporności na ciprofloksacynę (np. w wieloopornych organizmach), zarówno metoda dyfuzyjno-krążkowa, jak i w znacznie większym stopniu karta AST-N391 dla systemu VITEK 2 będą nadmiernie raportować niewrażliwość, ale jest mało prawdopodobne, by oznaczały izolaty jako fałszywie wrażliwe. Błędy dla metody dyfuzyjno-krążkowej występowały zwykle w pośrednich średnicach i są prawdopodobnie akceptowalne.

Podczas gdy nadmierne raportowanie oporności może wpływać na możliwości doustnego leczenia i zarządzanie antybiotykami, takie jak nadużywanie karbapenemów, testy te niezawodnie identyfikują niewrażliwość, a zatem bezpieczeństwo pacjentów przy zastosowaniu tych metod prawdopodobnie nie jest zagrożone. W przeciwieństwie do ciprofloksacyny, obecna karta AST-N391 dla systemu VITEK 2 działa odpowiednio przy kategoryzacji wrażliwości na gentamycynę i tobramycynę. Czy te wyniki mogą zmienić podejście do diagnostyki zakażeń ESBL-dodatnich i wpłynąć na decyzje terapeutyczne?

Komercyjne systemy takie jak VITEK 2 usprawniły określanie AST z hodowli i mają znacznie szybszy czas realizacji w porównaniu z klasycznymi technikami mikrorozcieńczeń w bulionie lub metodą dyfuzyjno-krążkową. Biorąc pod uwagę powszechne stosowanie tych komercyjnych metod, ich wydajność powinna być niezależnie oceniana. Niewiele badań podjęło się tego zadania; jedno godne uwagi doniesienie Huanga i współpracowników oceniło AST dla lewofloksacyny określone przez VITEK 2 w porównaniu z rozcieńczaniem na agarze w 253 izolatach z bakteriemii wywołanej przez Enterobacterales. Ich badanie wykazuje ogólny wskaźnik błędów mniejszych wynoszący 11,9%, wskaźnik ME 0% i wskaźnik VME 50%. Chociaż żadne badania nie oceniły formalnie wydajności VITEK 2 w bakteriach gram-ujemnych produkujących ESBL, podobne badanie obserwacyjne przeprowadzono dla bakteriemii z izolatami K. pneumoniae KPC. Autorzy donoszą o wskaźniku VME wynoszącym 1,6% i wskaźniku ME 21% dla gentamycyny.

Obserwacje badaczy, jak również doniesienia z literatury podkreślają znaczenie szybkiego i dokładnego AST w kontekście infekcji wielolekowoopornymi szczepami z niewielką liczbą opcji terapeutycznych. Te powinny być niezależnie oceniane przez poszczególne laboratoria. “Dokładność testów wrażliwości na antybiotyki ma kluczowe znaczenie dla optymalizacji terapii i poprawy wyników klinicznych u pacjentów z zakażeniami ESBL-dodatnimi” – podkreślają autorzy badania.

Mocnymi stronami pracy jest wykorzystanie dwóch najczęstszych Enterobacterales znajdowanych we krwi oraz użycie inwazyjnych próbek z wysokim prawdopodobieństwem posiadania oporności na ciprofloksacynę i aminoglikozydy z racji bycia już opornymi na ceftriakson. Jest to kluczowe, ponieważ gdy częstość występowania oporności w próbce jest niska, testowanie wrażliwości może wydawać się działać lepiej po prostu przez mniejszą liczbę okazji do błędu. Ograniczenia obejmują brak genetycznej charakterystyki izolatów, użycie tylko jednego modelu karty AST VITEK 2, użycie tylko izolatów z krwi i poleganie na próbkach z jednego miasta. Dodatkowo, różne replikaty biologiczne były używane do testów BMD i dyfuzyjno-krążkowych w porównaniu do VITEK 2 (przeprowadzonych w laboratoriach MUHC), co może stanowić niewielkie źródło błędu. Wreszcie, choć a priori zdecydowano o systematycznym włączeniu izolatów zarówno E. coli, jak i K. pneumoniae, całkowita liczba K. pneumoniae była stosunkowo ograniczona, a wyniki interpretowane z ostrożnością.

Wyniki przedstawionego badania mają istotne implikacje kliniczne, szczególnie w kontekście zarządzania antybiotykoterapią u pacjentów z zakażeniami wywoływanymi przez bakterie ESBL-dodatnie. Dotychczasowe podejście do testowania wrażliwości na antybiotyki w przypadku ciprofloksacyny przy użyciu systemu VITEK 2 może prowadzić do niepotrzebnego ograniczania opcji terapeutycznych, co w konsekwencji zwiększa presję selekcyjną na karbapenemy i może przyczyniać się do rozwoju oporności na tę grupę antybiotyków.

Szczególnie niepokojący jest wysoki wskaźnik błędów poważnych (ME) wynoszący 19% w przypadku ciprofloksacyny przy użyciu systemu VITEK 2, co oznacza, że niemal co piąty izolat faktycznie wrażliwy na ciprofloksacynę jest błędnie klasyfikowany jako oporny. W praktyce klinicznej może to prowadzić do niepotrzebnego wykluczania fluorochinolonów jako opcji terapeutycznej, co jest szczególnie problematyczne w przypadku pacjentów z zakażeniami ESBL-dodatnimi, gdzie możliwości leczenia są już ograniczone. “Nadmierne raportowanie oporności na ciprofloksacynę może prowadzić do niepotrzebnego stosowania karbapenemów, co w dłuższej perspektywie może przyczynić się do rozwoju oporności na tę grupę antybiotyków” – ostrzegają autorzy badania.

Warto podkreślić, że żadna z badanych metod nie wykazała bardzo poważnych błędów (VME) dla ciprofloksacyny, co oznacza, że nie ma ryzyka błędnego sklasyfikowania izolatu opornego jako wrażliwego. Jest to kluczowe z punktu widzenia bezpieczeństwa pacjenta, ponieważ zapobiega potencjalnie nieskutecznej terapii. Jednak z perspektywy zarządzania antybiotykami i antimicrobial stewardship, nadmierne raportowanie oporności również stanowi problem, prowadząc do niepotrzebnego stosowania antybiotyków o szerszym spektrum działania.

W przypadku aminoglikozydów, zarówno metoda dyfuzyjno-krążkowa, jak i system VITEK 2 wykazały doskonałą zgodność z referencyjną metodą BMD. Jest to obiecująca informacja, ponieważ aminoglikozydy stanowią ważną alternatywę dla karbapenemów w leczeniu zakażeń ESBL-dodatnich, szczególnie w przypadku zakażeń układu moczowego, gdzie osiągają wysokie stężenia. Dokładność testów wrażliwości dla tej grupy antybiotyków pozwala lekarzom na pewniejsze włączanie ich do schematów terapeutycznych.

Badanie podkreśla również znaczenie aktualizacji punktów odcięcia (breakpoints) dla interpretacji wyników testów wrażliwości na antybiotyki. Obniżenie punktów odcięcia dla fluorochinolonów w 2019 roku i dla aminoglikozydów w 2022 roku przez CLSI miało na celu lepsze wykrywanie klinicznie istotnej oporności o niskim poziomie. Wyniki badania potwierdzają zasadność tych zmian i podkreślają potrzebę regularnej oceny wydajności systemów AST w kontekście zmieniających się kryteriów interpretacyjnych.

Interesującym aspektem badania jest również wybór izolatów z krwi pacjentów z bakteriemią. Bakteriemia wywołana przez bakterie ESBL-dodatnie wiąże się z wysoką śmiertelnością, a szybkie wdrożenie odpowiedniej antybiotykoterapii jest kluczowe dla poprawy wyników leczenia. W tym kontekście, dokładność testów wrażliwości na antybiotyki nabiera szczególnego znaczenia. Czy laboratoria mikrobiologiczne powinny rozważyć stosowanie metody dyfuzyjno-krążkowej jako uzupełnienia lub alternatywy dla zautomatyzowanych systemów, przynajmniej w przypadku ciprofloksacyny?

Warto również zauważyć, że badanie koncentrowało się na dwóch najczęstszych patogenach z rodziny Enterobacterales – E. coli i K. pneumoniae. Te dwa gatunki odpowiadają za większość zakażeń ESBL-dodatnich, ale wyniki mogą nie być w pełni przekładalne na inne gatunki z tej rodziny. Ponadto, stosunkowo mała liczba izolatów K. pneumoniae (18 w porównaniu do 76 izolatów E. coli) sugeruje potrzebę ostrożności przy interpretacji wyników dla tego gatunku.

Z praktycznego punktu widzenia, badanie sugeruje, że laboratoria mikrobiologiczne powinny być świadome ograniczeń systemu VITEK 2 w testowaniu wrażliwości na ciprofloksacynę u izolatów ESBL-dodatnich. W przypadkach, gdy ciprofloksacyna może być ważną opcją terapeutyczną, warto rozważyć potwierdzenie wyników metodą dyfuzyjno-krążkową, która wykazała lepszą zgodność z referencyjną metodą BMD. “Nasze wyniki sugerują, że w przypadku izolatów ESBL-dodatnich, metoda dyfuzyjno-krążkowa może dostarczyć bardziej wiarygodnych informacji o wrażliwości na ciprofloksacynę niż system VITEK 2” – konkludują badacze.

Podsumowanie

Badanie koncentruje się na analizie skuteczności różnych metod testowania wrażliwości na antybiotyki w kontekście zakażeń bakteriami ESBL-dodatnimi. Porównano system VITEK 2 oraz metodę dyfuzyjno-krążkową z referencyjną metodą mikrorozcieńczeń w bulionie (BMD). Wyniki wykazały, że system VITEK 2 ma tendencję do nadmiernego raportowania oporności na ciprofloksacynę, ze wskaźnikiem błędów poważnych wynoszącym 19%. Metoda dyfuzyjno-krążkowa okazała się bardziej wiarygodna, nie wykazując błędów poważnych ani bardzo poważnych. W przypadku aminoglikozydów obie metody wykazały wysoką zgodność z BMD. Badanie podkreśla znaczenie dokładności testów wrażliwości dla optymalizacji terapii i wskazuje na potrzebę świadomości ograniczeń systemów automatycznych w testowaniu wrażliwości na ciprofloksacynę u izolatów ESBL-dodatnich. Wyniki mają istotne implikacje dla praktyki klinicznej i zarządzania antybiotykoterapią.

Bibliografia

Sohani Zahra N., Lieu Anthony, Semret Makeda, Cheng Matthew P., Simic Nancy, Bamba Reggie, Patel Mina, Lawandi Alexander and Lee Todd C.. Comparison of ciprofloxacin and aminoglycoside susceptibility testing for ceftriaxone non-susceptible Enterobacterales by disk diffusion and VITEK 2 vs. broth microdilution using updated Clinical and Laboratory Standards Institute breakpoints. BMC Microbiology 2025, 25(4), 159-166. DOI: https://doi.org/10.1186/s12866-025-03923-7.