Ceftriakson chroni mitochondria w chorobie Alzheimera przez GLT-1

Czy ceftriakson może chronić mitochondria w chorobie Alzheimera?

Choroba Alzheimera (AD) to postępujące schorzenie neurodegeneracyjne charakteryzujące się utratą pamięci, funkcji językowych i zdolności społecznych. Jednym z kluczowych mechanizmów patogenetycznych AD jest dysfunkcja mitochondriów – organelli odpowiedzialnych za produkcję ATP i utrzymanie homeostazy komórkowej. Rosnąca liczba dowodów wskazuje, że upośledzona aktywność metaboliczna mitochondriów, nieprawidłowa struktura oraz dysregulacja genów związanych z mitochondriami przyczyniają się do rozwoju choroby.

Szczególnie istotną rolę w patogenezie AD odgrywa zaburzenie homeostazy jonów wapnia (Ca²⁺). Dysfunkcja transportera glutaminianu GLT-1 (glutamate transporter-1) prowadzi do gromadzenia się glutaminianu w szczelinie synaptycznej i aktywacji pozasynaptycznych receptorów NMDA (eNMDAR). Aktywowane eNMDAR indukują napływ wapnia do komórek, co z kolei powoduje przeciążenie wapniowe mitochondriów, spadek potencjału błonowego mitochondriów (MMP) i ostatecznie śmierć neuronów.

Ceftriakson – antybiotyk β-laktamowy – wykazuje zdolność do zwiększania ekspresji i funkcji GLT-1. Wcześniejsze badania zespołu autorów wykazały, że ceftriakson poprawia funkcje poznawcze i plastyczność synaptyczną u myszy APP/PS1 poprzez zwiększenie ekspresji GLT-1 i wychwytu glutaminianu. Niniejsze badanie ma na celu pogłębienie wiedzy na temat mechanizmów ochronnych ceftriaksonu, ze szczególnym uwzględnieniem jego wpływu na dysfunkcję mitochondrialną wywołaną przez eNMDAR.

Jak zaprojektowano eksperyment z udziałem myszy APP/PS1?

W badaniu wykorzystano trzy typy 6-miesięcznych myszy: typu dzikiego (C57BL/6J), APP/PS1 (model AD) oraz APP/PS1/GLT-1+/– (z knockdownem GLT-1). Myszy APP/PS1 rozwijają kluczowe cechy patologiczne AD do 6. miesiąca życia, w tym złogi β-amyloidu, nieprawidłowości związane z białkiem tau oraz deficyty poznawcze. Myszy APP/PS1/GLT-1+/– uzyskano poprzez hybrydyzację myszy APP/PS1 z myszami GLT-1+/–, u których zastosowano technologię CRISPR/Cas9 do wyeliminowania 480 pz sekwencji genu slcla2 zawierającej drugi ekson.

Zwierzęta podzielono na grupy eksperymentalne metodą prostej randomizacji, zapewniając równą liczbę samców i samic. Główne grupy to: typ dziki, APP/PS1, Cef+APP/PS1. Dodatkowo utworzono grupy z knockdownem GLT-1 (APP/PS1/GLT-1+/–, Cef+APP/PS1/GLT-1+/–) oraz grupy z aktywacją eNMDAR przez NMDA (APP/PS1+NMDA, Cef+APP/PS1+NMDA).

Ceftriakson podawano dootrzewnowo w dawce 200 mg/kg raz dziennie przez 14 kolejnych dni. Dawka ta została wybrana na podstawie wcześniejszych badań autorów, które wykazały znaczącą regulację w górę ekspresji GLT-1 i wychwytu glutaminianu u myszy APP/PS1. Grupom kontrolnym podawano roztwór soli fizjologicznej według tego samego schematu. NMDA (4 μM) wstrzykiwano do komory bocznej mózgu 12 godzin przed pierwszym podaniem ceftriaksonu lub soli fizjologicznej.

Między 8. a 15. dniem leczenia przeprowadzono testy behawioralne: test rozpoznawania nowego obiektu (NOR), test rozpoznawania nowej lokalizacji (NLR) oraz test labiryntu wodnego Morrisa (MWM). Po zakończeniu testów myszy uśmiercano, a hipokampy pobierano do analiz ultrastruktury mitochondriów (TEM), western blot (ekspresja eNMDAR oraz białek związanych z biogenezą i dynamiką mitochondriów: Drp1, PGC-1α, Nrf1, Mfn1) oraz pomiaru MMP.

Dodatkowo wykonano eksperymenty na pierwotnych hodowlach neuronów i astrocytów kory mózgowej myszy embrionalnych (12–14 DIV), aby zbadać zmiany w poziomach wapnia cytozolowego i mitochondrialnego oraz MMP po leczeniu ceftriaksonem. Wykorzystano obrazowanie wapnia za pomocą Fluo-4-AM (Ca²⁺ cytozolowy) i Rhod-2-AM (Ca²⁺ mitochondrialny) oraz pomiar MMP za pomocą rodaminy 123 (Rh-123).

Czy ceftriakson poprawia funkcje poznawcze u myszy AD?

Testy behawioralne potwierdziły, że ceftriakson znacząco poprawił krótko- i długoterminową pamięć rozpoznawczą oraz poznanie wzrokowo-przestrzenne u myszy APP/PS1. W teście NOR wskaźnik rozpoznania (RI) w grupie Cef+APP/PS1 był istotnie wyższy niż w grupie APP/PS1 zarówno po 1 godzinie, jak i po 24 godzinach (p<0,0001). Podobnie w teście NLR grupa leczona ceftriaksonem wykazała wyższy RI (p<0,0001).

W teście MWM myszy z grupy Cef+APP/PS1 prezentowały krótszy czas ucieczki (escape latency, p<0,0001), spędzały więcej czasu w kwadrancie docelowym i częściej przechodziły przez miejsce platformy w porównaniu z grupą APP/PS1 (p<0,0001). Co istotne, nie zaobserwowano różnic w średniej prędkości pływania między grupami (p=0,5396), co wyklucza wpływ deficytów motorycznych na wyniki testów.

Efekt terapeutyczny ceftriaksonu był całkowicie zależny od GLT-1. Knockdown GLT-1 zniwelował korzystne działanie leku – myszy z grupy Cef+APP/PS1/GLT-1+/– wykazały podobnie niskie wyniki w testach poznawczych jak grupa APP/PS1/GLT-1+/–. Ponadto aktywacja eNMDAR przez NMDA również zablokowała działanie ceftriaksonu: grupa Cef+APP/PS1+NMDA prezentowała istotnie gorsze wyniki niż grupa Cef+APP/PS1 we wszystkich testach behawioralnych (p<0,0001).

Jakie zmiany w mitochondriach wywołuje ceftriakson?

Mikroskopia elektronowa transmisyjna (TEM) ujawniła poważne uszkodzenia ultrastruktury mitochondriów w regionie CA1 hipokampu myszy APP/PS1, w tym obrzęk, degenerację wakuolarną, zaburzenia błon mitochondrialnych i kristalin wewnętrznych oraz zmniejszony stosunek aspektowy mitochondriów (aspect ratio). Po leczeniu ceftriaksonem uszkodzenia zostały złagodzone – większość mitochondriów w grupie Cef+APP/PS1 wykazywała wyraźną i nieuszkodzoną ultrastrukturę oraz wyższy aspect ratio niż u myszy APP/PS1.

Knockdown GLT-1 zniwelował efekt ochronny ceftriaksonu: mitochondria w grupie Cef+APP/PS1/GLT-1+/– wykazywały wyraźny obrzęk, degenerację wakuolarną, przerwanie błon i brak kristalin wewnętrznych w porównaniu z grupą Cef+APP/PS1 (p<0,0001). Podobnie, aktywacja eNMDAR przez NMDA zablokowała korzystny wpływ ceftriaksonu na ultrastrukturę mitochondriów (p<0,0001).

Pomiar potencjału błonowego mitochondriów (MMP) wykazał, że myszy APP/PS1 prezentowały istotny spadek MMP w porównaniu z myszami typu dzikiego. Ceftriakson zapobiegł temu spadkowi – MMP w grupie Cef+APP/PS1 był znacząco wyższy niż w grupie APP/PS1 (p<0,0001). Farmakologiczne zahamowanie GLT-1 przez kwas dihydrokainowy (DHK) zniosło korzystny efekt ceftriaksonu na MMP (p<0,0001). Dodatkowo, iniekcja NMDA znacząco obniżyła MMP u myszy APP/PS1 i zablokowała efekt ceftriaksonu (p<0,0001).

Analiza western blot ujawniła, że ekspresja Drp1 (białko uczestniczące w podziale mitochondriów) była znacząco zwiększona, podczas gdy poziomy PGC-1α, Nrf1 i Mfn1 (białka regulujące biogenezę i fuzję mitochondriów) były istotnie obniżone w grupie APP/PS1 w porównaniu z typem dzikim. Leczenie ceftriaksonem znormalizowało te zmiany: obniżyło poziom Drp1 i podwyższyło poziomy PGC-1α, Nrf1 i Mfn1 (wszystkie p<0,0001). Efekt ten był całkowicie zależny od GLT-1 i został zniesiony przez knockdown GLT-1 lub aktywację eNMDAR (p<0,0001).

Jak ceftriakson wpływa na ekspresję i funkcję eNMDAR?

Western blot wykazał znaczącą regulację w górę ekspresji GluN1 i GluN2B (podjednostki eNMDAR) we frakcji pozasynaptycznej hipokampu u myszy APP/PS1 w porównaniu z typem dzikim. Leczenie ceftriaksonem istotnie obniżyło ekspresję tych białek (p<0,0001). Poziomy GluN1 i GluN2B były znacząco wyższe u myszy APP/PS1/GLT-1+/– niż u APP/PS1, a knockdown GLT-1 zniósł zdolność ceftriaksonu do redukcji ekspresji eNMDAR (p<0,0001).

Aby zbadać funkcjonalne zmiany w eNMDAR po leczeniu ceftriaksonem, przeprowadzono eksperymenty na pierwotnych hodowlach neuronów i astrocytów kory mózgowej. Po zablokowaniu synaptycznych receptorów NMDA (sNMDAR) przez MK-801, ekspozycja na glutaminian (20 μM) wywołała przejściowe wzrosty Ca²⁺ cytozolowego, które zostały zredukowane przez D-APV (antagonistę NMDAR, p<0,0001) i zniesione przez bufor wolny od Ca²⁺, ale nie przez BAPTA-AM ani kwas cyklopiazonowy (CPA). To wskazuje, że napływ wapnia z przestrzeni pozakomórkowej przez eNMDAR jest głównym źródłem tych przejściowych wzrostów Ca²⁺.

Leczenie ceftriaksonem (100 μM przez 48 h) istotnie zmniejszyło szczytowe wartości przejściowych wzrostów Ca²⁺ cytozolowego wywołanych ekspozycją na glutaminian (p<0,0001), a efekt ten był zależny od dawki (0,1–100 μM, p<0,0001). Podanie DHK (100 μM) zniosło działanie ceftriaksonu (p<0,0001). Co istotne, w obecności D-APV ceftriakson nie wywołał dalszego zmniejszenia poziomu Ca²⁺ cytozolowego, podczas gdy w obecności CNQX (antagonista receptorów non-NMDA) lub nifedipiny (bloker kanałów wapniowych typu L) ceftriakson nadal redukował poziomy Ca²⁺ (p<0,0001). Te wyniki wskazują, że hamowanie eNMDAR jest głównym mechanizmem działania ceftriaksonu w redukcji napływu wapnia.

Dodatkowe eksperymenty wykazały, że ceftriakson (100 μM) hamował przejściowe wzrosty Ca²⁺ cytozolowego wywołane przez AMPA (50 μM, p=0,0002), ale nie wpływał na wzrosty wywołane przez kainian (KA, 50 μM, p=0,7095) ani KCl (50 mM, p=0,5310). To sugeruje, że hamowanie receptorów AMPA również przyczynia się do działania ceftriaksonu.

Czy ceftriakson chroni mitochondria przed przeciążeniem wapniowym?

Aby wyjaśnić mechanizm, dzięki któremu ceftriakson łagodzi dysfunkcję mitochondrialną wywołaną przez aktywację eNMDAR, zbadano związki między poziomem MMP a poziomami Ca²⁺ cytozolowego i mitochondrialnego w hodowlach neuronów leczonych ceftriaksonem. Ekspozycja na glutaminian po zablokowaniu sNMDAR wywołała znaczący spadek neuronalnego MMP, który został zniesiony przez D-APV (p<0,0001) i bufor wolny od Ca²⁺, częściowo zahamowany przez BAPTA-AM, ale nie przez CPA. To wskazuje na kluczową rolę napływu wapnia z przestrzeni pozakomórkowej przez eNMDAR w spadku MMP.

Leczenie ceftriaksonem (100 μM przez 48 h) istotnie zahamowało spadek neuronalnego MMP wywołany ekspozycją na glutaminian (p<0,0001), a efekt ten był zależny od dawki (0,1–100 μM, p<0,0001). Co ciekawe, efekt ceftriaksonu został zniesiony przez sperminę (10 μM, agonista MCU – mitochondrialnego uniportera wapniowego, p<0,0001). To sugeruje, że poziom mitochondrialnego Ca²⁺ jest możliwym celem działania ceftriaksonu w hamowaniu spadku MMP.

Dalsze badania wykazały, że ekspozycja na glutaminian znacząco zwiększyła neuronalne poziomy mitochondrialnego Ca²⁺, co zostało zniesione przez D-APV (p<0,0001) i bufor wolny od Ca²⁺, częściowo zahamowane przez BAPTA-AM, ale nie przez CPA. To wskazuje, że napływ wapnia z przestrzeni pozakomórkowej przez eNMDAR jest głównym źródłem mitochondrialnego Ca²⁺. Ceftriakson (100 μM) istotnie zahamował wzrost neuronalnego mitochondrialnego Ca²⁺ wywołany ekspozycją na glutaminian (p<0,0001), a efekt ten był zależny od dawki (0,1–100 μM, p<0,0001).

Dodatkowo wykazano, że neuronalny spadek MMP został zapobiegany przez zahamowanie MCU za pomocą RU360 (p<0,0001) i zahamowanie mitochondrialnego poru przejściowej przepuszczalności (mPTP) za pomocą cyklosporyny A (CSA, p<0,0001), a został nasilony przez aktywację MCU za pomocą sperminy (p<0,0001). Te wyniki wskazują, że wychwyt wapnia przez mitochondria i otwarcie mPTP są niezbędne do spadku MMP wywołanego przez eNMDAR.

„Leczenie ceftriaksonem zapobiegło regulacji w górę ekspresji eNMDAR i następującemu po niej napływowi wapnia z przestrzeni pozakomórkowej w sposób zależny od GLT-1, zmniejszając tym samym wapniowe obciążenie mitochondriów i ostatecznie łagodząc uszkodzenie mitochondriów oraz deficyty poznawcze u myszy APP/PS1″ – piszą autorzy badania.

Jakie są implikacje kliniczne tych odkryć?

Niniejsze badanie dostarcza nowych dowodów na to, że ceftriakson – poprzez regulację w górę GLT-1 – może chronić mitochondria przed uszkodzeniem wywołanym przez nadaktywację eNMDAR w modelu choroby Alzheimera. Mechanizm ten obejmuje: (1) zwiększenie wychwytu glutaminianu przez GLT-1, co zmniejsza aktywację eNMDAR; (2) redukcję napływu wapnia z przestrzeni pozakomórkowej przez eNMDAR; (3) zmniejszenie wapniowego przeciążenia mitochondriów; (4) zapobieganie spadkowi MMP i uszkodzeniu ultrastruktury mitochondriów; (5) normalizację ekspresji białek regulujących biogenezę i dynamikę mitochondriów.

Wyniki te mają istotne implikacje dla terapii AD. GLT-1 może być obiecującym celem terapeutycznym w chorobach związanych z zaburzeniem homeostazy wapnia i dysfunkcją mitochondrialną. Niemniej jednak długotrwałe stosowanie ceftriaksonu może prowadzić do działań niepożądanych, w tym dysbiozy jelitowej, lekooporności bakteryjnej oraz – jak wykazały niedawne badania – potencjalnych zaburzeń synaptycznych u młodych szczurów. Dlatego kluczowe jest poszukiwanie nowych leków o mniejszej liczbie działań niepożądanych, które mogłyby regulować GLT-1.

Badanie ma pewne ograniczenia. Po pierwsze, chociaż wyniki sugerują istotne hamowanie przez ceftriakson sygnałów wapniowych wywołanych przez eNMDAR w celu zapobiegania dysfunkcji mitochondrialnej neuronów, mogą istnieć inne mechanizmy zaangażowane w ochronny efekt mitochondrialny ceftriaksonu. Wcześniejsze badania wykazały, że leczenie antybiotykami poprawia funkcję mitochondriów i zmniejsza uszkodzenia oksydacyjne w kontekście AD. Na przykład ceftriakson zwiększał poziomy glutationu poprzez aktywację czynnika transkrypcyjnego Nrf2 in vitro. Wcześniejsze badania autorów wykazały również, że ceftriakson zwiększał ekspresję podjednostki katalitycznej systemu xc⁻ i poziom glutationu w hipokampie myszy APP/PS1, co zostało zahamowane przez knockdown GLT-1. Dlatego działanie antyoksydacyjne może również przyczyniać się do ochrony mitochondrialnej ceftriaksonu w AD.

Po drugie, jak zaobserwowano w niniejszym badaniu, wychwyt Ca²⁺ przez retikulum endoplazmatyczne (ER) przyczynia się do regulacji akumulacji Ca²⁺ wywołanej przez eNMDAR w cytoplazmie, co może łagodzić uszkodzenie mitochondriów. Transfer Ca²⁺ między ER a mitochondriami również przyczynia się do regulacji funkcji mitochondrialnej. Leczenie ceftriaksonem może również hamować akumulację Ca²⁺ w ER poprzez hamowanie napływu wapnia wywołanego przez eNMDAR. Nadmiar glutaminianu w ośrodkowym układzie nerwowym prowadzi do stresu ER. Niedawne odkrycia autorów wskazują, że ceftriakson zapobiega stresowi ER w hipokampie u myszy APP/PS1, co może być związane z jego mechanizmem ochrony mitochondrialnej. Jednak konieczne są dalsze badania w celu potwierdzenia tego założenia.

Co to badanie wnosi do naszej wiedzy o terapii AD?

Niniejsze badanie wykazuje, że ceftriakson w dawce 200 mg/kg i.p. przez 14 dni zapobiega regulacji w górę ekspresji eNMDAR i następującemu po niej napływowi wapnia z przestrzeni pozakomórkowej w sposób zależny od GLT-1, zmniejszając tym samym wapniowe przeciążenie mitochondriów i ostatecznie łagodząc uszkodzenie mitochondriów oraz deficyty poznawcze u myszy APP/PS1. Kluczowe ustalenia obejmują: (1) ceftriakson znacząco poprawia funkcje poznawcze (pamięć rozpoznawczą i wzrokowo-przestrzenną) u myszy APP/PS1 (p<0,0001); (2) lek chroni ultrastrukturę mitochondriów, zwiększa MMP i normalizuje ekspresję białek regulujących biogenezę i dynamikę mitochondriów (p<0,0001); (3) efekt terapeutyczny jest całkowicie zależny od GLT-1 – knockdown GLT-1 lub aktywacja eNMDAR znosi korzyści płynące z leczenia; (4) ceftriakson hamuje napływ wapnia przez eNMDAR i akumulację mitochondrialnego Ca²⁺, co zapobiega spadkowi MMP. Wyniki te sugerują, że regulacja w górę GLT-1 może odgrywać rolę przeciw-AD poprzez zapobieganie dysfunkcji mitochondrialnej wywołanej przez eNMDAR, dostarczając nowych dowodów na potencjał GLT-1 jako celu terapeutycznego w chorobach związanych z zaburzeniem homeostazy wapnia i uszkodzeniem mitochondriów.