Druk 3D w medycynie: nowe możliwości w rekonstrukcji kostnej

Czy druk 3D otwiera nowe horyzonty w rekonstrukcji kostnej?

Rozwój druku 3D w medycynie przynosi przełomowe rozwiązania w leczeniu krytycznych ubytków kostnych, które stanowią istotne wyzwanie w praktyce ortopedycznej. Badacze opracowali innowacyjny implant kostny wytwarzany techniką stereolitografii (SLA), uwalniający ceftriakson, który może zrewolucjonizować podejście do rekonstrukcji kostnych połączonych z profilaktyką przeciwbakteryjną.

Tradycyjne metody leczenia ubytków kostnych, takie jak przeszczepy autologiczne i allogeniczne, wiążą się z licznymi ograniczeniami, w tym ryzykiem infekcji, reakcjami immunologicznymi, powikłaniami w miejscu pobrania oraz ograniczoną dostępnością odpowiednich przeszczepów. Syntetyczne substytuty kostne stanowią obiecującą alternatywę dzięki możliwości dostosowania właściwości fizykochemicznych i zapewnieniu powtarzalności produkcji. Powszechnie stosowane materiały obejmują bioszkoło, ceramikę fosforanu wapnia, fosforan trójwapniowy, hydroksyapatyt i cementy fosforanowo-wapniowe, które często wykazują jednak suboptymalne właściwości mechaniczne i profile biodegradacji.

Technologia druku 3D zrewolucjonizowała produkcję rusztowań kostnych poprzez precyzyjną kontrolę parametrów architektonicznych, umożliwiając odtworzenie złożonej struktury i właściwości mechanicznych naturalnej kości. Dzięki ciągłym postępom w materiałach do druku, od metali po niemetale, a nawet komórki biologiczne, implanty drukowane 3D wykazały potencjał do zastępowania różnych struktur anatomicznych, w tym obojczyka, mostka i klatki piersiowej, kości szczęki górnej i dolnej, kosteczek słuchowych, kręgosłupa i czaszki. “Technologia ta polega na wykorzystaniu żywic utwardzanych światłem, które ulegają sieciowaniu i polimeryzacji pod wpływem promieniowania ultrafioletowego” – wyjaśniają autorzy badania.

Stereolitografia (SLA), uznawana za jedną z najwcześniejszych technik druku 3D, wyróżnia się wysoką precyzją, efektywnością kosztową i stosunkowo niskimi wymaganiami dotyczącymi płynności żywicy. Ta technologia opiera się na żywicach utwardzanych światłem, które ulegają sieciowaniu i polimeryzacji pod wpływem światła ultrafioletowego, przy czym rodzaj i stężenie żywicy światłoczułej znacząco wpływają na proces utwardzania. Powszechnie stosowane materiały w SLA obejmują fumaran propylenu (PPF), polikaprolakton (PCL), poli-(D,L-laktyd) (PDLLA) i fumaran polipropylenowy-fumaran dietylowy (PPF-DEF). Jednak zastosowanie kliniczne tych materiałów jest często ograniczone ze względu na obawy dotyczące ich niewystarczającej biokompatybilności.

Innowacyjnym aspektem badania jest wykorzystanie materiałów dentystycznych, które oferują szereg korzyści w porównaniu do standardowych materiałów SLA, takich jak niższy współczynnik skurczu, szybszy czas utwardzania i lepsza biokompatybilność. Godne uwagi przykłady to karbaminian dimetakrylanu (UDMA), dimetakrylan etoksylowanego bisfenolu A (BPA2EODMA), dimetakrylan glikolu trietylenowego (TEGDMA) i dimetakrylan glikolu etylenowego (EGDMA). UDMA i BPA2EODMA to monomery makrocząsteczkowe charakteryzujące się wysoką lepkością, które tworzą główne składniki sieci sieciowania żywicy i bezpośrednio wpływają na wydajność produktu końcowego. BPA2EODMA wykazuje znacznie wyższą lepkość niż UDMA, zwiększając przyczepność płynnej żywicy. Z kolei TEGDMA i EGDMA to monomery małocząsteczkowe, które poprawiają płynność i mogą służyć jako rozcieńczalniki do regulacji lepkości żywicy matrycowej. Jednak TEGDMA jest uważany za bezpieczniejszy i bardziej stabilny niż EGDMA.

Jak innowacyjne materiały i technologie wpływają na jakość implantów?

Kluczowym elementem opracowanego implantu jest funkcja antybakteryjna, uzyskana poprzez inkorporację ceftriaksonu sodowego (CRO). Ten antybiotyk z grupy cefalosporyn trzeciej generacji działa bakteriobójczo poprzez hamowanie syntezy ściany komórkowej bakterii, wykazując silne działanie przeciwko bakteriom Gram-dodatnim i Gram-ujemnym, w tym Pseudomonas aeruginosa oraz bakteriom beztlenowym. Dodatkowo CRO charakteryzuje się wysoką stabilnością wobec β-laktamaz i niską nefrotoksycznością, co czyni go odpowiednim antybiotykiem do zapobiegania infekcjom okołooperacyjnym. Jest szeroko stosowany w warunkach klinicznych do leczenia zapalenia płuc, infekcji brzusznych i zakażeń układu moczowo-płciowego. Czy lokalne uwalnianie antybiotyku bezpośrednio z implantu może skuteczniej zapobiegać infekcjom pooperacyjnym niż tradycyjna antybiotykoterapia systemowa?

W badaniu wybrano BPA2EODMA jako matrycę żywicy, podczas gdy TEGDMA służył jako aktywny rozcieńczalnik, mający na celu przezwyciężenie ograniczeń w biokompatybilności obecnych materiałów do wytwarzania przyrostowego. Jako fotoinicjator zastosowano tlenek difenylo(2,4,6-trimetylobenzoilo)fosfiny (TPO). Mimo że TPO budzi obawy dotyczące potencjalnej cytotoksyczności i genotoksyczności, pozostaje szeroko stosowanym fotoinicjatorem w systemach żywic utwardzanych światłem. Badania wykazały, że jego toksyczność może być znacznie zminimalizowana w zoptymalizowanych warunkach utwardzania. Ze względu na wysoką wydajność kwantową i szybką efektywność fotopolimeryzacji – kluczowe dla osiągnięcia skutecznego i równomiernego utwardzania – TPO został wybrany na podstawie zrównoważonego rozważenia bezpieczeństwa i wydajności funkcjonalnej.

Badacze przeprowadzili szereg testów mechanicznych, strukturalnych i biologicznych, aby zoptymalizować skład i właściwości implantu. Systematyczna ocena właściwości lepkosprężystych formulacji BPA2EODMA/TEGDMA ujawniła krytyczne zależności struktura-proces-właściwość, które znacząco wpływają na drukowalność rusztowania. Charakterystyka reologiczna w temperaturze 25°C wykazała wyraźnie różne profile lepkości dla czystych monomerów: 500-700 cps dla BPA2EODMA w porównaniu do 10,2 cps dla TEGDMA. Ta znaczna różnica lepkości bezpośrednio wpłynęła na płynność formulacji, skłaniając do wykluczenia stosunków 8:2 i 9:1 (BPA2EODMA:TEGDMA) ze względu na niewystarczającą lepkość dla optymalnego przetwarzania.

Testy wytrzymałościowe wykazały, że optymalna proporcja BPA2EODMA do TEGDMA wynosi 7:3, zapewniając maksymalną wytrzymałość na rozciąganie na poziomie 36,61 ± 2,03 MPa. “Gdy proporcja BPA2EODMA wzrasta powyżej stosunku 7:3, lepkość mieszaniny staje się znacznie wyższa, zmniejszając płynność żywicy. To zmniejszenie płynności może prowadzić do słabej adhezji międzywarstwowej i niekompletnego utwardzania podczas procesu druku 3D” – zauważają badacze. Dodatkowo, wyższa lepkość może ograniczać zdolność materiału do odpowiedniego wypełniania form lub tworzenia jednolitej struktury, co może prowadzić do słabych punktów lub niewystarczającego wiązania między łańcuchami polimerowymi.

Testy ściskania wykazały, że implanty osiągają wytrzymałość na ściskanie 9,54 ± 0,75 MPa, co przewyższa wartości dla ludzkiej kości beleczkowej (2-12 MPa), pozostając jednocześnie poniżej progu dla kości korowej (>100 MPa). Potwierdza to przydatność materiału do zastosowań nieobciążających, takich jak rekonstrukcja czaszkowo-twarzowa. Krzywe naprężenie-odkształcenie rusztowań wykazywały liniową elastyczność do 4,50 ± 0,53% odkształcenia, po czym następowało kruche pękanie. Ogólnie rzecz biorąc, formulacja żywicy zoptymalizowana przy stosunku BPA2EODMA do TEGDMA 7:3 nie tylko wykazała doskonałą drukowalność, ale także zapewniła wystarczającą wytrzymałość mechaniczną do podtrzymywania otaczających tkanek we wczesnym okresie pooperacyjnym.

Czy wyniki badań potwierdzają bezpieczeństwo i skuteczność implantów?

Analiza mikrostrukturalna za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM) ujawniła istotne różnice morfologiczne między powierzchnią rusztowania a obszarami zawierającymi lek. Rusztowanie polimerowe wykazywało gęstą, nieporowatą strukturę powierzchniową, co koreluje ze zwiększoną wytrzymałością na ściskanie. Taka gęsta morfologia zapewnia również lepszą stabilność mechaniczną, zmniejszoną szybkość degradacji i zwiększoną odporność na infiltrację mikrobiologiczną – czynniki kluczowe dla utrzymania integralności implantu w początkowych fazach gojenia. Natomiast centralny obszar implantu wykazywał ziarnistą lub porowatą morfologię, co może być przypisane przemianom polimorficznym matrycy polimerowej lub modelowego leku podczas procesu utwardzania. Zaobserwowane zróżnicowanie strukturalne sugeruje potencjalny mechanizm kontrolowanego uwalniania leku, gdzie gęsta warstwa powierzchniowa może początkowo opóźniać wymywanie leku, podczas gdy porowaty rdzeń służy jako rezerwuar leku.

Biorąc pod uwagę, że TPO został niedawno przeklasyfikowany przez rozporządzenie REACH (Rejestracja, Ocena, Autoryzacja Chemikaliów) Unii Europejskiej, a następnie oznaczony jako substancja CMR (rakotwórcza, mutagenna, toksyczna dla rozrodczości) “wzbudzająca szczególne obawy”, istotna była ocena jego toksyczności. W badaniu stężenie dodanego TPO wynosiło 1% (w/w), przekraczając próg 0,1%. Jednak badania wykazały, że toksyczność TPO może być zmniejszona, gdy jest on mieszany z materiałami żywicznymi i stosowane są zoptymalizowane warunki utwardzania. Ponadto, wielu producentów stosuje stężenia TPO w zakresie od 1 do 1,5%, co stanowi użyteczny punkt odniesienia dla wyboru dawki TPO w tym badaniu.

Ocena biokompatybilności przeprowadzona zgodnie z normą ISO 10993-5 potwierdziła, że implanty nie wykazują cytotoksyczności. Względna aktywność komórek narażonych na najwyższe stężenie ekstraktu z próbki (100%) pozostawała powyżej 70% aktywności grupy kontrolnej, co według norm ISO klasyfikuje materiał jako nietoksyczny. Ponadto, doniesienia wskazywały, że wymywanie wolnych monomerów, takich jak TEGDA, może prowadzić do śmierci komórek. Jednak w eksperymentach dotyczących cytotoksyczności nie zaobserwowano takiego zjawiska, co sugeruje, że materiały zostały w pełni usieciowane i utwardzone. Dodatkowo, gęsta struktura rusztowania skutecznie zapobiega wymywaniu wewnętrznych monomerów, co jest zgodne z wynikami SEM.

Profil uwalniania leku z implantów wykazał charakterystyczną dwufazową kinetykę: początkowe szybkie uwolnienie (w ciągu 24 godzin), a następnie przedłużone uwalnianie aż do osiągnięcia plateau po 96 godzinach. Ten profil jest klinicznie korzystny, ponieważ szybkie początkowe uwolnienie dostarcza terapeutycznie skuteczne stężenie leku, zapobiegając ostrym infekcjom pooperacyjnym lub stanom zapalnym, podczas gdy przedłużone uwalnianie wspiera gojenie ran w krytycznej wczesnej fazie regeneracji.

Skumulowane uwalnianie z implantów CRO było zmniejszone przy 5% stężeniu leku w porównaniu do stężeń 10% i 1%. To zmniejszenie może wynikać ze zwiększonych interakcji między CRO a matrycą żywicy przy pośrednich stężeniach. Ponadto, implanty CRO z 10% stężeniem leku wykazywały zwiększone uwalnianie po 72 godzinach, prawdopodobnie ze względu na większą obecność kryształów. Gdy hydroliza degraduje sieć polimerową, kryształy te rozpuszczają się, tworząc mikroporowate kanały, które przyspieszają dyfuzję leku.

Badania wykazały również wpływ czasu utwardzania światłem na uwalnianie leku. Implanty zawierające lek utwardzane przez 4 minuty wykazały średnie skumulowane uwolnienie 60% po 72 godzinach. Z kolei te utwardzane przez krótszy czas (2 i 3 minuty) wykazały znacznie wyższe uwalnianie leku, osiągając odpowiednio około 73% i 78%. Trend ten sugeruje, że dłuższe czasy utwardzania mogą prowadzić do gęściej usieciowanej sieci polimerowej na powierzchni implantu, ograniczając tym samym dyfuzję leku z matrycy. Zaobserwowany wzrost skumulowanego uwalniania przy dłuższych czasach utwardzania można przypisać zwiększonej integralności strukturalnej żywicy, co może ułatwić bardziej kontrolowane wymywanie leku, zapobiegając przedwczesnemu rozpadowi matrycy.

Jakie praktyczne korzyści dla chirurgów ortopedów niesie nowe podejście?

Interesujące jest, że profile skumulowanego uwalniania wykazały nieznaczne różnice między trzema projektami śrub. To podobieństwo można przypisać ich prawie identycznym powierzchniom narażonym na medium uwalniające. Spójność była szczególnie widoczna przy 5% i 10% zawartości leku, co sugeruje, że kinetyka uwalniania jest regulowana głównie przez rozpuszczanie leku i erozję matrycy, a nie przez makroskopową geometrię implantu.

Badania antybakteryjne wykazały, że implanty skutecznie hamują wzrost Staphylococcus aureus, Escherichia coli oraz Candida albicans. Po 8 godzinach inkubacji, strefy zahamowania wzrostu dla S. aureus i E. coli stanowiły odpowiednio 49,14 ± 4,89% i 48,38 ± 5,88% całkowitej powierzchni płytki hodowlanej. Implanty wykazywały również działanie przeciwgrzybicze, z strefami zahamowania stanowiącymi 26,79 ± 2,69% całkowitej powierzchni po 8 godzinach. Wyniki te potwierdzają, że implant może wywierać hamujący wpływ na mikroorganizmy w krótkim czasie. Wykazuje silne działanie hamujące zarówno wobec bakterii Gram-dodatnich, jak i Gram-ujemnych, a także wykazuje aktywność przeciwgrzybiczą.

Szczególnie istotne z punktu widzenia klinicznego są wyniki badań na zakażonych komórkach. Przy stężeniu bakterii 5 × 10⁷ CFU/ml, implanty zawierające 5% CRO wykazywały szybkie uwalnianie leku, skutecznie zapobiegając rozległej śmiertelności komórek wynikającej z zakażeń bakteryjnych. Wskaźnik przeżywalności komórek w grupie z implantem CRO osiągnął 89,35 ± 5,29%, nie wykazując istotnej różnicy w porównaniu z grupą otrzymującą czysty CRO. Jednak gdy stężenie bakterii przekroczyło zakres poddający się leczeniu antybiotykami, zarówno grupa z implantem, jak i grupa z czystym lekiem doświadczyły zwiększonej śmiertelności komórek, z wskaźnikami przeżywalności komórek odpowiednio 40,68 ± 4,68% i 48,56 ± 5,52%. Zależne od czasu uwalnianie leku w grupie z implantem prowadziło do nieco zmniejszonego efektu terapeutycznego w porównaniu z grupą z czystym lekiem.

Według efektów terapeutycznych CRO i implantów CRO na komórki L929 zakażone różnymi szczepami mikrobiologicznymi, grupa z implantem CRO nie wykazała istotnych różnic w porównaniu z grupą CRO w różnych szczepach mikroorganizmów, demonstrując zastosowanie implantów w różnych scenariuszach leczenia mikrobiologicznego.

Jakie są praktyczne implikacje tego badania dla chirurgów ortopedów? Opracowany implant oferuje unikalne połączenie właściwości mechanicznych i terapeutycznych, które mogą znacząco poprawić wyniki leczenia krytycznych ubytków kostnych. Możliwość personalizacji geometrii implantu dzięki technologii druku 3D, w połączeniu z lokalnym uwalnianiem antybiotyku, stwarza nowe możliwości w leczeniu skomplikowanych przypadków, zwłaszcza u pacjentów z wysokim ryzykiem infekcji.

Architektura rusztowania została zoptymalizowana poprzez modelowanie obliczeniowe, aby spełnić podwójne wymagania mechaniczne i biologiczne. W szczególności struktury musiały wykazywać wystarczającą wytrzymałość mechaniczną i integralność strukturalną dla zastosowań nośnych, jednocześnie utrzymując wewnętrzną porowatość, która ułatwia dyfuzję składników odżywczych i infiltrację komórek. Wysoka dokładność wymiarowa i drukowalność były również niezbędne do zagwarantowania spójności i powtarzalności drukowanych produktów.

Mimo obiecujących wyników, badanie ma pewne ograniczenia. Wykorzystanie wyłącznie modeli in vitro uniemożliwia kompleksową ocenę kluczowych parametrów biologicznych, w tym potencjału osteointegracji, odpowiedzi tkanki gospodarza i ogólnoustrojowej farmakokinetyki leku. Ponadto, monoterapeutyczne podejście wykorzystujące ceftriakson jako jedyny środek przeciwbakteryjny rodzi obawy dotyczące potencjalnego rozwoju oporności, kwestii nieporuszonej w zakresie tego badania. Wreszcie, brak długoterminowych danych dotyczących degradacji ogranicza nasze zrozumienie integralności strukturalnej implantu w klinicznie istotnych ramach czasowych.

Przyszłe badania powinny skupić się na kompleksowej ocenie in vivo na odpowiednich modelach zwierzęcych, aby ocenić kinetykę osteointegracji, lokalną i ogólnoustrojową biokompatybilność oraz skuteczność zapobiegania infekcjom. Konieczne jest również opracowanie podejść kombinacyjnych łączących środki przeciwzapalne lub czynniki osteogenne w celu rozwiązania wieloczynnikowych powikłań pooperacyjnych oraz wdrożenie strategii zarządzania antybiotykami, potencjalnie poprzez systemy podwójnego dostarczania leków lub podejścia modyfikacji powierzchni w celu złagodzenia oporności. Ponadto, szczegółowe profilowanie farmakokinetyczne i badania zwiększania skali zgodne z zasadami Dobrej Praktyki Wytwarzania (GMP) będą niezbędnymi warunkami wstępnymi dla translacji klinicznej.

Podsumowując, badanie to ustanawia solidne podstawy do wykorzystania zmodyfikowanych żywic dentystycznych w produkcji wielofunkcyjnych implantów ortopedycznych uwalniających leki. Konwergencja technologii druku 3D z możliwościami uwalniania środków przeciwdrobnoustrojowych stanowi znaczący postęp w kierunku spersonalizowanych, odpornych na infekcje urządzeń do mocowania kości dla interwencji ortopedycznych wysokiego ryzyka.

Podsumowanie

Opracowany implant kostny wykorzystuje technologię druku 3D (stereolitografię) oraz innowacyjne materiały dentystyczne do tworzenia spersonalizowanych implantów o właściwościach mechanicznych zbliżonych do naturalnej kości. Kluczowym elementem jest możliwość uwalniania ceftriaksonu – antybiotyku skutecznego przeciwko szerokiemu spektrum bakterii. Implanty wykazują dwufazową kinetykę uwalniania leku: szybkie uwolnienie w pierwszych 24 godzinach, a następnie przedłużone uwalnianie do 96 godzin. Badania potwierdziły skuteczność przeciwbakteryjną wobec Staphylococcus aureus, Escherichia coli oraz działanie przeciwgrzybicze przeciw Candida albicans. Testy mechaniczne wykazały odpowiednią wytrzymałość implantów do zastosowań nieobciążających, a badania biokompatybilności potwierdziły brak cytotoksyczności. Ta innowacyjna technologia stanowi znaczący postęp w leczeniu ubytków kostnych, łącząc możliwości rekonstrukcyjne z profilaktyką przeciwbakteryjną.